棉花GhIAA14基因的分子克隆、组织表达与功能分析

【摘要】棉纤维是棉花胚珠上的单细胞表皮毛,其发育过程是一个受数千个基因共同调控的复杂有序的生物学进程。棉纤维发育相关基因的克隆、表达调控及功能鉴定研是阐明棉纤维细胞发育分子机理的最重要途径之一。棉花纤维细胞的伸长直接影响皮棉的品质和产量,因此,纤维伸长相关基因的研究还可以为棉花纤维性状的遗传改良和分子育种提供重要的理论依据和候选基因。李氏无长绒纤维突变体(Ligonlintless-1,Li-I)胚珠长绒纤维细胞能正常起始,但是伸长受阻,只能形成不能直接用于纺纱的短纤维,因此是研究棉纤维伸长发育机制的理想材料。本实验室前期曾采用Microarray对Li-1及其野生型近等基因系TM-1(WT)的0DPA(Daypostanthesis)胚珠及3DPA、DPA纤维基因表达谱进行了差异分析,发现了生长素(IAA)在纤维伸长发育中起关键作用,其中一个Aux/IAA基因(EST:gi|48744526)在Li-1纤维下调表达,推测该基因可能与棉纤维细胞伸长有关。在此基础上,本文进行了进一步研究并得到如下结果：1.采用RACE技术克隆了该基因的cDNA全长,其蛋白质序列与拟南芥AtIAA14(Aux/IAA家族成员蛋白)相似度为81%,故将其暂命名为GhIAA14。GMAA14开放阅读框全长为759bp,共编码252个氨基酸,理论等电点和分子量分别为4.96和60.59kD,具有典型的Aux/IAA家族结构域。2.采用洋葱表皮瞬时表达系统进行亚细胞定位分析,结果显示GhIAA14是一个核蛋白。3.对GhIAA14基因的时空表达特征进行实时荧光定量PCR分析,结果表明该基因在TM-1纤维中表达水平显著高于根、茎、叶,且在Li-1突变体ODPA胚珠及3DPA、6DPA、10DPA、20DPA纤维中的表达量明显低于TM-1,说明GhIAA14可能在棉纤维起始和伸长发育时期发挥作用。4.采用RNA原位杂交技术对GhIAA14基因的组织表达特征进行研究,发现该基因在棉花ODPA胚珠表皮纤维细胞凸起、3和6DPA的棉纤维细胞中特异性表达,且野生型TM-1纤维细胞中的信号强于Li-1突变体,进一步证实了该基因与纤维细胞的起始和伸长发育有关。5.构建GhIAA14基因的植物表达载体,转入农杆菌GV3101菌株,再通过浸花法将其导入到Col-0生态型拟南芥中,卡那霉素筛选和PCR检测获得了转基因拟南芥阳性苗,表型观察发现转基因拟南芥叶片小而发黄或不能长出真叶,部分叶片失水,根的总长度变短、根毛减少且存在部分致死现象。说明ChIAA14的过量表达对植物生长发育有害,适量表达可能是植物发育所必需的。
【作者】韩美玲；
【导师】刘康；
【作者基本信息】南京农业大学，遗传学，2013，硕士
【关键词】棉花；生长素；GhIAA14；RNA原位杂交；拟南芥转基因；

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